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Apr 28, 2023

El análisis del microbioma de la soja fermentada tradicional tailandesa revela

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7573 (2023) Citar este artículo

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Thua Nao es un alimento tradicional tailandés de soja fermentada y un suplemento proteico de bajo costo. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la comunidad bacteriana en Thua Nao del norte de Tailandia y evaluar las bacterias relacionadas con los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) potencialmente activas. Se recolectaron sesenta y cinco Thua Nao que consisten en 30 muestras húmedas y 35 secas de seis provincias: Chiang Rai, Chiang Mai, Mae Hong Son, Lampang, Lamphun y Phayao. La diversidad bacteriana fue significativamente mayor en las muestras húmedas que en las muestras secas. Los filos dominantes fueron Firmicutes (92,7 %), Proteobacteria (6,7 %), Actinobacteriota (0,42 %) y Bacteroidota (0,26 %). El género Bacillus (67%) fue el más representado en todas las muestras. Lactobacillus, Enterococcus y Globicatella se enriquecieron en las muestras húmedas. La evaluación de las relaciones SCFA-microbiota reveló que las concentraciones altas de butirato y propionato se asociaron con una mayor abundancia de Clostridiales, y las concentraciones altas de acetato se asociaron con una mayor abundancia de Weissella. Los productos húmedos contenían más SCFA, incluidos acetato (P = 2,8e-08), propionato (P = 0,0044), butirato (P = 0,0021) e isovalerato (P = 0,017), que los productos secos. Estos resultados brindan información sobre las asociaciones SCFA-microbiota en Thua Nao, lo que puede permitir el desarrollo de cultivos iniciadores para la producción de Thua Nao enriquecida con SCFA.

Thua Nao (soja fermentada) es un alimento del norte de Tailandia con un alto valor nutricional y es similar a productos como el natto en Japón, el chongkukjang en Corea y el kinema en India1. Se requieren tres ingredientes principales (es decir, soja, agua y microbios naturales) para producir Thua Nao, que se produce en cuatro pasos principales: remojo, ebullición, fermentación y posfermentación. La ebullición destruye los gérmenes y bacterias no resistentes al calor, preservando así las bacterias resistentes al calor. El proceso de fermentación dura 3 días en condiciones ambientales. El Thua Nao recién preparado o húmedo se puede cocinar al vapor o asar antes de consumirlo. En condiciones ambientales, Thua Nao húmedo se puede almacenar durante aproximadamente 2 días. Por ello, se han desarrollado procesos de post-fermentación para prolongar su vida útil. Por ejemplo, Thua Nao cocinado se tritura en un disco plano circular y luego se seca al sol, lo que da como resultado la forma seca de Thua Nao, que se puede almacenar durante varios meses1.

Un estudio anterior demostró el valor de Thua Nao como un recurso potencial para compuestos bioactivos y que promueven la salud2. Thua Nao contiene 57,22–64,78 % de humedad, 4,70–5,44 % de ceniza, 12,92–28,06 % de fibra cruda, 38,94–42,06 % de proteína cruda y 20,37–25,22 % de grasa3. Los beneficios potenciales de los compuestos bioactivos, como los compuestos fenólicos y las actividades antioxidantes, no solo se derivan de las materias primas, sino que también se liberan de las bacterias durante la fermentación de la soja3. Utilizando métodos dependientes del cultivo, se informa que las especies de Bacillus son microorganismos predominantes en Thua Nao4. Sin embargo, Thua Nao está hecho de una mezcla de microflora natural, que no se puede cultivar fácilmente. El proceso de fermentación con microflora mixta permite que los microorganismos se ayuden mutuamente a producir sustancias importantes relacionadas con la nutrición y la salud, como péptidos, vitamina B, ácidos grasos y ácidos grasos de cadena corta (SCFA). La digestión de la soja por la microflora crea SCFA, es decir, acetato, propionato y butirato, que sirven como nutrientes esenciales para las células de la mucosa del colon, estimulando así la proliferación de la mucosa y el flujo sanguíneo5 y controlando los niveles de azúcar5, el metabolismo6 y los niveles de colesterol7. Por lo tanto, Thua Nao se considera una buena fuente de sustancias importantes, prebióticos y bacterias beneficiosas para la salud.

Thua Nao se produce en varias regiones del norte de Tailandia; sin embargo, los datos sobre las comunidades bacterianas en Thua Nao de diferentes áreas aún son limitados. El estudio de las comunidades bacterianas puede permitir una mejor comprensión de los roles y las propiedades funcionales de las bacterias en fermentación en Thua Nao. Los microbios utilizados para la fermentación natural proceden del cultivo de la soja. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que diferentes regiones de cultivo de soja o condiciones geográficas podrían influir en la composición de la microbiota y, en última instancia, en la composición de SCFA. Natto podría ser un buen control en comparación con otros alimentos fermentados (p. ej., pescado fermentado y encurtidos) porque también es una soja fermentada, pero con la adición de Bacillus como cultivo iniciador. Para abordar esto, primero identificamos los taxones bacterianos en Thua Nao de seis áreas diferentes en el norte de Tailandia utilizando enfoques independientes de la cultura (es decir, secuenciación del gen 16S rRNA). En segundo lugar, analizamos las correlaciones entre los taxones bacterianos y los tipos y cantidades de SCFA en Thua Nao mediante cromatografía gas-líquido. Los resultados revelaron las bacterias beneficiosas que pueden usarse como cultivos iniciadores para mejorar la calidad de producción de Thua Nao.

Sesenta y cinco muestras de Thua Nao, que consistían en soja fermentada seca y húmeda, se recolectaron de 37 aldeas en seis provincias del norte de Tailandia. También se utilizó natto comercial como muestra de soja fermentada no tradicional (control; n = 1), que se obtuvo de un supermercado en Tailandia. La Figura 1 muestra un mapa de Tailandia con los números de muestreo en cada provincia.

Lugares de muestreo y número de Thua Nao secos y húmedos en el norte de Tailandia. El número en el centro del círculo representa el número de pueblos en cada provincia, mientras que el número en los colores naranja y verde indica el número de muestras secas y húmedas en cada provincia, respectivamente. El mapa se descargó de Google Data Studio y se dibujaron gráficos y punteros adicionales con Microsoft Excel v16.66.1, Microsoft PowerPoint v16.66.1 e Inkscape v1.1.

La mediana del número de secuencias de lectura de extremo emparejado de 250 pb sin procesar generadas por la secuenciación de Illumina con los genes de ARNr 16S fue 66 438 (rango 36 740–82 116). Después del preprocesamiento, la mediana del número de secuencias se redujo a 48.645,5 (rango 31.864-60.876). Luego, las secuencias se agruparon en 652 características basadas en el método de variante de secuencia de amplicón (ASV) con la mayor parte de la longitud de secuencia de 253 pb correspondiente al tamaño aproximado de la región V4 de los genes 16S rRNA. El archivo complementario S1 muestra las tablas de abundancia taxonómica en los niveles de filo y género.

Sesenta y seis muestras de soja fermentada (30 Thua Nao húmedo, 35 Thua Nao seco y 1 natto) se obtuvieron y analizaron en busca de comunidades bacterianas en función de la diversidad de secuencias del gen 16S rRNA. Se identificaron cuatro filos en ambos tipos de soja fermentada. Firmicutes fue el filo más común en los tipos seco (95,98% + 11,55%), húmedo (88,42% + 15,46%) y ambos (92,66% + 13,71%) (Fig. 2A). Las abundancias relativas de Proteobacteria, Actinobacteriota y Bacteroidota fueron 10,26 %, 0,85 % y 0,47 % en las muestras húmedas, respectivamente, y 3,85 %, 0,08 % y 0,09 % en las muestras secas, respectivamente (Fig. 2B). Doce géneros tuvieron ≥ 1% de abundancia relativa (Fig. 2D). Bacillus fue el género dominante en los tipos seco (86,41% + 16,41%), húmedo (47,19% + 30,63%) y ambos (66,94% + 32,25%; Fig. 2D). Curiosamente, Lactobacillus, Enterococcus y Globicatella se enriquecieron en las muestras húmedas.

Se compararon los porcentajes de abundancia relativa de las composiciones taxonómicas entre soja fermentada seca (n = 35) y húmeda (n = 30) en los niveles de phylum (A) y género (B) y entre las seis provincias en el phylum (C) y género (D) niveles.

Las diversidades alfa se estimaron para todos los perfiles de microbioma de la soja fermentada y se compararon entre soja seca y fermentada en húmedo según la diversidad de Shannon (Fig. 3A), la diversidad de Simpson (Fig. S1B), el índice de Pielou (Fig. S1C) y la diversidad filogenética de Faith (Fig. S1D) utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Todas las métricas de diversidad alfa mostraron que las diversidades microbianas de la soja fermentada húmeda eran significativamente más altas que las de la soja fermentada seca. Se midieron las diversidades beta entre muestras de soja fermentada (Fig. 3 y S2). Las diferencias entre los tipos de soja fermentada se evaluaron mediante pruebas PERMANOVA (Fig. 3B), que indicaron que la soja fermentada húmeda y seca y el natto tenían diferentes patrones de microbiota (P = 1e-04). Se identificaron taxones abundantes diferenciales entre soja seca y fermentada húmeda con el criterio de corte P < 0.05 (Fig. 3C y D).

Comparación de diversidades bacterianas en soja fermentada seca (rojo; n = 35) y húmeda (azul; n = 30) y natto (verde; n = 1). Pruebas de significación estadística para la diversidad alfa entre soja seca y fermentada en húmedo con base en la diversidad de Shannon (A). Diversidad beta entre soja seca y fermentada en húmedo y natto basada en la disimilitud de Bray-Curtis y PERMANOVA (B). Análisis de abundancia diferencial entre soja fermentada seca y húmeda en los niveles de filo (C) y género (D) utilizando métodos ANCOM-BC; el valor Q representa un valor P que se ha ajustado para la tasa de descubrimiento falso (FDR).

Las composiciones bacterianas entre las semillas de soja fermentadas mostraron que Lampang tenía la mayoría de los géneros bacterianos (14 géneros) con ≥ 1 % de abundancia relativa, seguido de Chiang Mai, Chiang Rai, Phayao, Mae Hong Son y Lamphun (Fig. 2D). Curiosamente, las Proteobacterias tenían menor abundancia en Chiang Rai y Phayao que en las otras provincias (Fig. 2C).

Las diversidades alfa en términos de diversidad de Shannon, diversidad de Simpson, índice de Pielou y diversidad filogenética de Faith se compararon entre las seis provincias mediante pruebas de Kruskal-Wallis (Fig. S3). Los resultados estadísticos indicaron que las diversidades microbianas entre las seis provincias diferían significativamente en condiciones húmedas según la diversidad filogenética de Faith (P = 0,0011; Fig. 4A). Sin embargo, las diversidades alfa no fueron significativamente diferentes entre las seis provincias en la condición seca (P = 0,06; Fig. 4B). Las diversidades alfa en Chiang Rai, Chiang Mai y Lampang fueron más altas que las de Lamphun, Mae Hong Son y Phayao. Las diferencias entre dos muestras cualesquiera se midieron en función de la disimilitud de Bray-Curtis, la distancia Jaccard, la distancia UniFrac ponderada y la distancia UniFrac no ponderada (Fig. S4). Las diversidades beta basadas en cuatro métricas se analizaron y visualizaron mediante gráficos de análisis de coordenadas principales (PCoA) (Fig. S4). PERMANOVA indicó diferencias significativas en los perfiles bacterianos de las seis provincias (P = 0,001; Figs. 4C y S3).

Comparación de diversidades filogenéticas bacterianas y disimilitud en soja fermentada entre provincias. Pruebas de significación estadística para la diversidad alfa entre las provincias basadas en la diversidad filogenética de Faith en condiciones húmedas (n = 30) (A) y secas (n = 35) (B) utilizando pruebas de Kruskal-Wallis. La diversidad beta entre la soja seca y fermentada en húmedo de seis provincias y el natto japonés (n = 1) basada en la disimilitud de Bray-Curtis se analizó a través de PERMANOVA (C).

Las semillas de soja fermentadas se midieron en cuanto a sus niveles de SCFA. Acetato (P = 2,8e−08), propionato (P = 0,0044), butirato (P = 0,0021) e isovalerato (P = 0,017) fueron mayores en la soja fermentada húmeda (n = 30) que en la soja fermentada seca (n = 35) basado en las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon (Fig. 5A). Las formas seca y húmeda de la soja fermentada no diferían significativamente en isobutirato, valerato, hexanoato o SCFA totales (Fig. 5A). Las concentraciones de fermentación en las formas seca y húmeda de la soja fermentada fueron más altas para el ácido acético que para los otros SCFA (Fig. 5A). El acetato y el isovalerato fueron los más abundantes en Chiang Rai y Lampang; el isobutirato y los SCFA totales fueron dominantes en Chiang Rai (Fig. 5B). Lampang y Chiang Mai contenían las cantidades más altas de propionato y butirato, respectivamente (Fig. 5B). Chiang Mai tenía la mayor cantidad de hexanoato (Fig. 5B). Las seis provincias tenían las concentraciones más altas de fermentación de acetato en Thua Nao (Fig. 5B).

Comparación de las concentraciones de SCFA en la soja fermentada. La soja fermentada seca (n = 35) y húmeda (n = 30) se comparó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (A) y se evaluó entre seis provincias mediante la prueba de Kruskal-Wallis con un punto de corte de P < 0,05 (B).

Las correlaciones (R) entre las abundancias bacterianas y las concentraciones de SCFA basadas en el coeficiente de correlación de Spearman fueron bajas y no significativas (P > 0,05) (Fig. 6 y Tabla S4). Los mayores valores de R se encontraron entre el aumento de Weissella (R = 0,45), Lactobacillus (R = 0,47) o Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,46) abundancias y concentraciones de acetato (Tabla S4). Utilizando un límite del 1 % para la abundancia relativa, Weissella se encontró en Chiang Rai, Lampang y Phayao; Lactobacillus se encontró en Chiang Rai y Lampang, y Clostridium_sensu_stricto-18 se encontró solo en Lampang (Tabla S4). Para aumentar los niveles de propionato, Globicatella (R = 0,40), Ignatzschineria (R = 0,5), Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0,44), Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,66), Paenalcaligenes (R = 0,40) o Staphylococcus (R = 0,46). ) fueron los mayores miembros bacterianos en la soja fermentada (Tabla S4). Globicatella y Clostridium_sensu_stricto-15 se encontraron en Lampang; Ignatzschineria se encontró en Lampang, Chiang Mai y Chiang Rai; Paenalcaligenes se encontró en Lampang y Chiang Mai, y Staphylococcus se encontró en Chiang Mai y Phayao, con una abundancia relativa ≥ 1% (Tabla S3). En comparación con otras abundancias bacterianas, Globicatella (R = 0,44), Ignatzschineria (R = 0,56), Corynebacterium (R = 0,49), Sphingobacterium (R = 0,49), Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0,50), Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,59) ), Vagococcus (R = 0,41), Paenalcaligenes (R = 0,40), Staphylococcus (R = 0,44) y Comamonas (R = 0,40) fueron los que más impactaron en el aumento de las concentraciones de butirato (Tabla S4). Además, el aumento de los SCFA totales se basó en el aumento de la abundancia de Weissella (R = 0,44) y Lactobacillus (R = 0,46) (Tabla S4). Corynebacterium se encontró en Chiang Mai; Se encontró Sphingobacterium en Lampang; Se encontró Vagococcus en Lampang y Chiang Mai, y Comamonas en Mae Hong Son, todos con una abundancia relativa ≥ 1% (Tabla S3).

Correlaciones por pares entre SCFA y géneros bacterianos dominantes con las abundancias totales más altas en muestras de > 0,1 % utilizando el coeficiente de correlación de Spearman.

En este estudio, caracterizamos la microbiota de Thua Nao de diferentes áreas del norte de Tailandia e identificamos las bacterias beneficiosas que potencialmente sintetizan SCFA. Presumimos que las materias primas utilizadas en la producción de Thua Nao (es decir, la soja y la flora natural de cada área) producirían diversos resultados de clasificación bacteriana. También evaluamos dos tipos de Thua Nao, húmedo y seco, utilizando la secuenciación del gen 16S rRNA, un método independiente del cultivo. A nivel de filo, Firmicutes fue el más abundante y común en los productos de soya fermentados húmedos y secos (Fig. 2A). Los miembros de Firmicutes incluyen principalmente bacterias beneficiosas que desempeñan un papel importante en la relación entre las bacterias intestinales y la salud humana. Algunos miembros de Firmicutes pueden fermentar la fibra dietética de las legumbres a productos finales de metabolitos, incluidos los SCFA8. Analizamos más a fondo los géneros predominantes de Firmicutes con ≥ 1% de abundancia. Los presentes resultados sugirieron que Bacillus era el más abundante tanto en las muestras húmedas como en las secas, lo que concordaba con las composiciones microbianas reportadas previamente2,4,9. Como era de esperar, Bacillus también fue el género bacteriano predominante en la muestra de natto, que fue el control en este trabajo. Sin embargo, solo teníamos una muestra para natto, lo que no nos permitió realizar ninguna prueba estadística entre natto y Thua Nao.

Teniendo en cuenta las diferencias en la diversidad bacteriana entre Thua Nao húmedo y seco, los análisis de abundancia diferencial mostraron una gran abundancia de bacterias productoras de ácido láctico (BAL). Los inoculantes de LAB se utilizan para producir diversos productos animales y vegetales y para desarrollar sabores, aromas y texturas en alimentos fermentados10. Las diferentes proporciones de LAB en las muestras húmedas y secas podrían ser factores en la viabilidad de las LAB en conservas de Thua Nao. Se ha informado que dos géneros de LAB, Lactobacillus y Enterococcus, muy abundantes en muestras húmedas, son capaces de hidrolizar proteínas de soja11,12. Lactobacillus spp. se utilizan comúnmente como probióticos para suplementos humanos y animales, y los cultivos mixtos de Lactobacillus se utilizan para fermentar la harina de soja13. Aunque algunos enterococos se consideran determinantes patógenos, estas bacterias también tienen varias características positivas. Se han descrito muchas cepas de enterococos eficaces como iniciadores potenciales en varios productos fermentados. El uso de enterococos como cultivos iniciadores o cocultivos se ha incrementado considerablemente. Sin embargo, los factores naturales mixtos de los sustratos de soja y otras bacterias predominantes (como Bacillus, LAB y otros miembros bacterianos), así como otros microbios (como levaduras y mohos), pueden crear sabores, aromas, texturas y valores nutritivos únicos en húmedo Thua Nao.

Thua Nao es un alimento fermentado popular en el norte de Tailandia porque se puede utilizar como ingrediente para aumentar el sabor de los alimentos cocinados y se puede comer directamente con arroz glutinoso o arroz1. Varios factores en la fabricación de Thua Nao, incluidos los tipos y la cantidad de fibras en la soja cruda, la microbiota natural, el medio ambiente y la duración de la fermentación varían entre las provincias, lo que da como resultado distintos perfiles de microbioma y diferentes sabores de Thua Nao. Nuestros resultados indican que las muestras de Thua Nao de Lampang, Chiang Mai y Chiang Rai tenían una mayor diversidad microbiana que las de Lamphun, Mae Hong Son y Phayao en condiciones húmedas (Fig. 4A).

Thua Nao contiene altas concentraciones de carbohidratos no digeribles, que no pueden ser digeridos por enzimas endógenas en el estómago y el intestino delgado, pero son un sustrato de fermentación potencial para microbios beneficiosos en el intestino y se consideran prebióticos14,15,16. La fermentación con microbios beneficiosos naturales en la producción de alimentos fermentados implica la hidrólisis de carbohidratos no digeribles en azúcares, que posteriormente se fermentan para producir principalmente SCFA, así como H2 y CO216,17. Varios estudios informaron que los tipos y cantidades de SCFA dependen en gran medida de la digestibilidad bacteriana y la fermentabilidad y viscosidad de la fibra16,17. Los tres SCFA principales, ácido acético (C2), ácido propiónico (C3) y ácido butírico (C4), ayudan a liberar energía para el crecimiento microbiano intestinal y los efectos fisiológicos en humanos16. Los SCFA son volátiles y pueden producirse por fermentación anaeróbica de fibras dietéticas6,18. Estos metabolitos fueron significativamente más altos en Thua Nao húmedo que en Thua Nao seco (Fig. 5A), posiblemente debido a su volatilidad y actividades enzimáticas anaeróbicas destruidas durante el proceso de secado15,18,19.

El ácido acético fue el SCFA más abundante tanto en muestras secas como húmedas de Thua Nao. Estudios previos revelaron que los principales productores de ácido acético en la fermentación sólida incluyeron Clostridium anaerobia, Ignatzschineria, LAB y bacterias aerobias del ácido acético (BAA)20,21,22. En este estudio, Clostridium sensu stricto, Ignatzschineria, LAB (es decir, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Globicatella, Vagococcus y Weissella) y AAB (es decir, Acetobacter) en Thua Nao podrían estar asociados con la producción de ácido acético durante la fermentación. Las dos concentraciones más altas de ácido acético encontradas en Chiang Rai y Lampang correspondieron al predominio de LAB, AAB, Ignatzschineria y Clostridium spp.

Las tres principales vías de formación de propionato son las vías de succinato, acrilato y propanodiol23. Propionibacterium y Clostridium, que son anaerobios, se han explorado como posibles productores de propionato a través de la vía del succinato20,24. El análisis de correlación mostró que las concentraciones de propionato estaban estrechamente relacionadas con las abundancias de Globicatella, Ignatzschineria, Clostridium sensu stricto, Paenalcaligenes y Staphylococcus. Se informa que Clostridium, Ignatzschineria y Paenalcaligenes son productores potenciales de ácido propiónico25,26. Aunque Ignatzschineria y Paenalcaligenes pertenecen al filo Proteobacteria, implicado en infecciones humanas27, estos géneros se encontraron en cantidades muy bajas (< 1 %) en Thua Nao seco (Tabla S2). La mayor cantidad de ácido propiónico se observó en Lampang, seguida de Chiang Mai, y correspondió a las mayores abundancias relativas de Globicatella, Clostridium sensu stricto y Staphylococcus.

El análisis de correlación mostró que las concentraciones de butirato estaban estrechamente relacionadas con la abundancia de Globicatella, Ignatzschineria, Corynebacterium, Sphingobacterium, Clostridium sensu stricto, Vagococcus, Paenalcaligenes, Staphylococcus y Comamonas. Estudios previos demostraron que el butirato puede generarse a partir de la fermentación de BAL como Globicatella, Vagococcus, Staphylococcus; especies de Bacillus; Corynebacterium, Comamonas, Sphingobacterium, Ignatzschineria; y Clostridium sensu stricto28,29,30. La mayor cantidad de ácido butírico se observó en Chiang Mai, seguida de Lampang, y correspondió a las mayores abundancias relativas de Corynebacterium en Chiang Mai, Sphingobacterium y Vagococcus en Chiang Mai y Lampang, Globicatella y Clostridium sensu stricto en Lampang y Comamonas en Mae. Hong Son. El análisis de correlación mostró que las concentraciones totales de SCFA estaban estrechamente relacionadas con las abundancias relativas de Weissella y Lactobacillus. Las cantidades más altas de SCFA totales observadas en Chiang Rai correspondieron a las abundancias relativas más altas de Weissella y Lactobacillus.

Nuestros resultados indican que tanto Thua Nao húmedo como seco de las provincias del norte de Tailandia son fuentes potenciales de SCFA. En particular, utilizamos un enfoque de microbioma basado en amplicón para observar las comunidades bacterianas en Thua Nao, y los resultados se basaron en bacterias a nivel de género. Este estudio proporciona información sobre las asociaciones SCFA-microbiota en Thua Nao, que podrían usarse para desarrollar un cultivo iniciador para la producción de soja fermentada enriquecida con SCFA como alimento complementario para modular la salud de por vida. El efecto del microbioma en Thua Nao en los productos finales de fermentación SCFA debe investigarse más a fondo utilizando otros enfoques, incluida la metagenómica de escopeta, la secuenciación del genoma y la metabolómica.

Se recolectaron sesenta y cinco productos Thua Nao (muestras de soja fermentada naturalmente) que consisten en 30 muestras húmedas y 35 secas de 36 aldeas en seis provincias del norte de Tailandia: Chiang Rai (14 secas, 5 húmedas), Chiang Mai (5 secas, 5 húmedas). ), Mae Hong Son (5 secos, 5 húmedos), Lampang (5 secos, 8 húmedos), Lamphun (5 secos, 5 húmedos) y Phayao (1 seco, 2 húmedos). También usamos natto, una soja de Japón fermentada usando un agente leudante como control. En 27 de 36 aldeas, recolectamos muestras de soja fermentada húmeda y seca. Se analizó el contenido de humedad para determinar el peso.

El ADN genómico total se extrajo de 67 muestras utilizando el kit microbiano DNeasy® Power Food® (Qiagen, MD, EE. UU.). La concentración de ADN se determinó utilizando un instrumento Nanodrop (Thermo Scientific, EE. UU.). La integridad del ADN se controló en gel de agarosa al 1%. Las muestras de ADN extraídas se enviaron al Genome Quebec Innovation Center (Universidad McGill, Montreal, QC, Canadá) para la amplificación por PCR, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. Se realizó PCR para producir regiones V4 del gen 16S rDNA utilizando los cebadores conservados 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) y 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). Se utilizó un sistema de PCR de alta fidelidad FastStart® (Roche, Mannheim, Alemania) para 26 ciclos de amplificación. Se utilizó una muestra en blanco sin plantilla de ADN como control negativo. La biblioteca se secuenció en una plataforma Illumina MiSeq según el protocolo de la empresa y se generaron lecturas de extremos emparejados de 250 pb. Se utilizó una comunidad simulada (Zymo Research, EE. UU.), que incluía 10 especies bacterianas, como control positivo.

El análisis SCFA se realizó usando cromatografía de gases según los métodos de 31,32 con ligeras modificaciones. Se mezcló un gramo de muestras molidas de Thua Nao con 3 ml de solución estándar interna (ácido heptanoico, 5,04 µM/g de muestra). Las muestras se agitaron y centrifugaron a 2500 × g a 4 °C durante 10 min, luego se agregaron 10 µL de ácido fosfórico 1 M a 300 µL del sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm y se inyectaron 0,2 µL del filtrado en un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama (GC-FID, modelo 7890A; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU. ) y columna capilar (DB-FFAP, 30 m × 0,53 mm × 0,5 µm). La temperatura inicial del horno se mantuvo a 90 °C durante 1 min, luego se aumentó a 20 °C/min hasta 190 °C y se mantuvo durante 2,5 min. Las temperaturas del inyector y del detector se fijaron en 210 °C. Se usó helio como gas portador con velocidades de flujo de gas y de purga del septo de 7,7 y 3,0 ml/min, respectivamente. Para el cálculo se utilizó una mezcla estándar de SCFA que contenía acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato y hexanoato, así como fenol y p-cresol. Las concentraciones de SCFA se calcularon en µM/g. La cuantificación se realizó en función del área relativa del pico de cada estándar SCFA, ajustando la cantidad en función del estándar interno.

Las secuencias eran lecturas de extremos emparejados de 250 pb en formato FASTQ. Las secuencias se importaron a QIIME2-2022.233. Los adaptadores y los cebadores se recortaron desde el frente de las lecturas directa e inversa utilizando q2-cutadapt. Las secuencias se truncaron en las posiciones de avance y retroceso; Luego, las lecturas de extremos emparejados se fusionaron con regiones superpuestas en secuencias representativas de V4 16S rRNA, y las secuencias quiméricas se descartaron usando q2-dada2. Las secuencias preprocesadas se agruparon en características según el método de variante de secuencia de amplicón, y los recuentos de características en las muestras se organizaron en una tabla de abundancia34. Las características se anotaron taxonómicamente según SILVA v13835. Se aplicó la normalización de rarefacción para hacer que todas las muestras fueran comparables con el mismo número de lecturas. Las abundancias taxonómicas de todas las muestras se calcularon utilizando q2-classify-sklearn.

Las abundancias taxonómicas a nivel de género se utilizaron para calcular las métricas de diversidad. Se estimó la diversidad alfa basada en la diversidad de Shannon, la diversidad de Simpson, la uniformidad de Pielou y la distancia filogenética de Faith para todas las muestras. La diversidad alfa se comparó entre los tipos de soja mediante las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y se evaluó entre provincias mediante las pruebas de Kruskal-Wallis. Las comparaciones por pares entre provincias se realizaron utilizando las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon con múltiples correcciones de hipótesis. Se calculó la diversidad beta en términos de disimilitud de Bray-Curtis, índice de Jaccard, distancia filogenética UniFrac y distancia filogenética UniFrac ponderada para todas las muestras. La PCoA se realizó con Phyloseq v1.36.036.

Se realizó ANCOM-BC v1.2.237,38,39 para identificar microbios diferencialmente abundantes entre soja fermentada húmeda y seca con el criterio P < 0,05.

Los taxones con abundancias relativas totales < 0,1% se filtraron de la tabla taxonómica. Las correlaciones por pares entre los perfiles taxonómicos y las concentraciones de SCFA se calcularon mediante el coeficiente de correlación de Spearman y se visualizaron mediante ggplot2 v3.3.5.

Las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y las pruebas de Kruskal-Wallis se realizaron en R, v4.1.0. Los diagramas de caja y PCoA se crearon con ggplot2 v3.3.5.

Los datos de secuenciación se enviaron a NCBI SRA con los números de acceso SRR20217885– SRR20217951 con el número de acceso de BioProject PRJNA852866.

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Agradecemos a Traci Raley, MS, ELS, de Edanz (www.edanz.com/ac) por editar un borrador de este manuscrito.

PJI recibió el apoyo del Premio de Investigación en Salud de BRAND 2019 y la Subvención del Consorcio de Ingeniería Biomédica y Biomateriales MU-KMUTT 2021.

Estos autores contribuyeron por igual: Thidathip Wongsurawat y Sawannee Sutheeworapong.

División de Bioinformática Médica, Departamento de Investigación, Facultad de Medicina Hospital Siriraj, Universidad Mahidol, Bangkok, 10700, Tailandia

Thidathip Wongsurawat y Piroon Jenjaroenpun

Siriraj Long-Read Lab (Si-LoL), Facultad de Medicina Hospital Siriraj, Bangkok, 10700, Tailandia

Thidathip Wongsurawat y Piroon Jenjaroenpun

Laboratorio de Biología de Sistemas y Bioinformática, Instituto de Capacitación y Desarrollo de Plantas Piloto, Universidad Tecnológica del Rey Mongkut Thonburi, Bangkok, 10150, Tailandia

Sawannee Sutheeworapong

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Agroindustria, Universidad de Kasetsart, Bangkok, 10900, Tailandia

Suvimol Charoensiddhi

Programa de Bioinformática y Biología de Sistemas, Escuela de Biorecursos y Tecnología y Escuela de Tecnología de la Información, Universidad Tecnológica del Rey Mongkut Thonburi, Bangkok, 10150, Tailandia

Ahmad Nur ad-Din Khoiri

Departamento de Medicina Tropical Molecular y Genética, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Bangkok, 10400, Tailandia

Supachai Topanurak

Departamento de Protozoología, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Bangkok, 10400, Tailandia

Chantira Sutthikornchai

Departamento de Nutrición Tropical y Ciencia de los Alimentos, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Bangkok, 10400, Tailandia

Pornrutsami Jintaridth

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Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Thidathip Wongsurawat o Pornrutsami Jintaridth.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wongsurawat, T., Sutheeworapong, S., Jenjaroenpun, P. et al. El análisis del microbioma de la soja fermentada tradicional tailandesa revela taxones bacterianos asociados a ácidos grasos de cadena corta. Informe científico 13, 7573 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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Recibido: 27 agosto 2022

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 10 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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